实验准备： 细胞， ，，，，，，，24孔板， ，，，，，，，细胞小室（8μm， ，，，，，，，24孔板专用）， ，，，，，，，ECM Gel， ，，，，，，，10%FBS+作育基， ，，，，，，，无血清作育基， ，，，，，，，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头， ，，，，，，，1.5 mL EP管， ，，，，，，，冰盒
实验设计：
实验分组一样平常分为
阴性组（上下层均没有趋化因素）， ，，，，，，，
实验组（凭证实验需要， ，，，，，，，上层或者下层加入趋化因素）， ，，，，，，，
比照组（趋化因素与实验组中的相反）。 。。。。 。。若是有特殊需要， ，，，，，，，可以再加上
阳性组（上下层都有趋化因素）。 。。。。 。。
实验操作（请细读注重事项）：
一、细胞侵袭实验
1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻， ，，，，，，，实验前转移到冰盒中。 。。。。 。。
2.将1.5 mL EP、枪头盒、细胞小室放在24孔板内里后， ，，，，，，，置于冰上预冷。 。。。。 。。
3.凭证自己的使用量， ，，，，，，，凭证ECM Gel : 无血清作育基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。 。。。。 。。
4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸收40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻加入小室上室中， ，，，，，，，加入时逐步移动枪头， ，，，，，，，包管液体平铺在底部。 。。。。 。。
5.放在37 ℃孵箱15 min， ，，，，，，，让胶凝固。 。。。。 。。
6.消化、离心、计数细胞后， ，，，，，，，凭证2.5x10^4 / mL用无血清作育基稀释细胞， ，，，，，，，制成细胞悬液（若是细胞许多， ，，，，，，，这一步可以提前， ，，，，，，，在4、5之前做）。 。。。。 。。
7.凭证每孔200 μL， ，，，，，，，将细胞悬液加入小室上室， ，，，，，，，同时在小室下室加入10%FBS+作育基500 μL， ，，，，，，，放入37 ℃孵箱作育。 。。。。 。。
8.若干小时后取出， ，，，，，，，吸去小室上室多余液体， ，，，，，，，用PBS洗濯两次， ，，，，，，，用棉棒在上室中轻轻转动， ，，，，，，，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 。。。。 。。
9.在上室中加入结晶紫染液， ，，，，，，，染色5 min， ，，，，，，，接纳染液， ，，，，，，，用流水徐徐冲去染液， ，，，，，，，再次用棉棒在上室中轻轻转动， ，，，，，，，吸干水分。 。。。。 。。 10.在正置显微镜上安排一块载玻片， ，，，，，，，将细胞小室的小孔倒置放在上面， ，，，，，，，照相。 。。。。 。。
11.在100倍视野下， ，，，，，，，对膜的上下左右及中心计数， ，，，，，，，做平均数。 。。。。 。。
二、细胞迁徙实验
细胞迁徙实验不需要ECM Gel包被， ，，，，，，，其余办法一致。 。。。。 。。
实验原理：多孔膜是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）， ，，，，，，，膜带有微孔， ，，，，，，，孔径巨细有0.1－12.0 μm。 。。。。 。。将细胞小室放入对应的作育板中， ，，，，，，，小室内称上室， ，，，，，，，作育板内称下室， ，，，，，，，上室内艳服上层作育液， ，，，，，，，下室内艳服下层作育液， ，，，，，，，上下层作育液以聚碳酸酯膜相隔。 。。。。 。。将细胞种在上室内， ，，，，，，，由于聚碳酸酯膜有通透性， ，，，，，，，下层作育液中的因素可以影响到上室内的细胞， ，，，，，，，从而可以研究下层作育液中的因素对细胞生长、运动等的影响。 。。。。 。。
细胞迁徙和侵袭实验常用8.0μm膜， ，，，，，，，上室种肿瘤细胞， ，，，，，，，下室加入FBS或某些特定的趋化因子， ，，，，，，，肿瘤细胞会向营养因素高的下室运动， ，，，，，，，从而从多孔膜一侧穿过， ，，，，，，，贴壁于多孔膜的另一侧， ，，，，，，，计数其细胞量可反应肿瘤细胞的迁徙或者侵袭能力（圆形透明小孔为微孔）。 。。。。 。。（注：迁徙和侵袭是两个看法， ，，，，，，，迁徙是指细胞的运动能力， ，，，，，，，而侵袭是细胞在运动的同时会渗透出消化ECM的卵白， ，，，，，，，扫除运动障碍， ，，，，，，，这个实验更能模拟人体内情形）
注重事项
1.ECM Gel（货号：E1270）由Sigma公司生产， ，，，，，，，泉源于大鼠肉瘤的细胞外基质提取物， ，，，，，，，生涯在-20℃， ，，，，，，，由于在室温中会快速凝固， ，，，，，，，不可逆， ，，，，，，，因此需要在冰上消融和操作， ，，，，，，，同时一切要与ECM Gel接触的耗材也需要预冷， ，，，，，，，阻止俩者接触时温差较大引起ECM Gel凝固粘附， ，，，，，，，造成铺张。 。。。。 。。
2.制作ECM Gel使用液时， ，，，，，，，先加入作育基， ，，，，，，，再加入ECM Gel；；；；；； ；同时在使用量的基础上多设置5-20 uL（使用量多就多配点）， ，，，，，，，阻止液体挂壁造成最后一次加样不敷。 。。。。 。。
3.加胶时， ，，，，，，，胶的量以恰恰把胶浸湿为最好（24孔的millicell需要35-40uL）， ，，，，，，，过厚细胞侵袭变慢， ，，，，，，，过少则失去侵袭实验的意义；；；；；； ；完成后可轻轻地， ，，，，，，，匀称地拍打作育板四个侧面， ，，，，，，，让液体完全平铺， ，，，，，，，这样可以阻止由于胶的厚薄不均而引起的误差。 。。。。 。。
4.凝固时间可以适当延伸， ，，，，，，，但最好不要凌驾30min， ，，，，，，，避免液体挥发使gel凝固得过硬。 。。。。 。。
5.通常先凭证细胞的侵袭能力预计每孔小室加入的细胞数目， ，，，，，，，侵袭能力强的细胞（如231， ，，，，，，，CAF）每孔加入5,000个， ，，，，，，，那最后的细胞悬液应该制备成2.5x104/mL， ，，，，，，，而侵袭能力弱的细胞（如MCF-7）可以提高细胞数目， ，，，，，，，抵达10,000个， ，，，，，，，那最后的细胞悬液应该制备成5x104/mL。 。。。。 。。上层加入细胞悬液后可轻轻地， ，，，，，，，匀称地拍打作育板四个侧面， ，，，，，，，让液体完全平铺， ，，，，，，，阻止细胞漫衍不均而引起细胞计数时中心多双方少。 。。。。 。。
6.加入下室中的10%FBS是作为趋化因子诱导细胞运动， ，，，，，，，24孔板下室一样平常加入500μl含FBS的作育基， ，，，，，，，差别的作育板加的量有差别要求， ，，，，，，，详细请参考说明书。 。。。。 。。这里要特殊注重的是， ，，，，，，，下层作育液和小室间常唬唬�；；； ；嵊衅荼�， ，，，，，，，一旦爆发气泡， ，，，，，，，气泡处的趋化作用就削弱甚至消逝了， ，，，，，，，在种板的时间要特殊留心， ，，，，，，，小室在放入时倾斜缓慢放入（注重小室中的液体不要流出）， ，，，，，，，可以阻止气泡。 。。。。 。。作育时间需要自己凭证文献做预实验， ，，，，，，，寻找合适的时间点；；；；；； ；时间点的选择除了要思量到细胞细胞侵袭力外， ，，，，，，，细胞数及处置惩罚因素对细胞数目的影响也不可忽视， ，，，，，，，穿过的细胞数在100-200之间最好。 。。。。 。。棉签洗濯时一定要轻柔， ，，，，，，，避免戳破多孔膜。 。。。。 。。
7.结晶紫是细胞核染液， ，，，，，，，细胞巨细差别， ，，，，，，，染色时间也有改变， ，，，，，，，染液安排的时间和浓度也会对染色时间有影响， ，，，，，，，需要自己掌握；；；；；； ；最优的染色状态是细胞核颜色深， ，，，，，，，胞浆色浅。 。。。。 。。
