实验质料：
DMEM高糖作育基
FBS/NBS
HT选择作育基
CO2细胞作育箱
细胞计数器
单通道移液枪、多通道移液枪
相差显微镜
生物清静柜
10μL、200μL、1000μL吸头
96/24/6孔细胞作育板
15mL、50mL无菌离心管
100mm细胞作育皿
T75细胞作育瓶
96孔酶标板
实验准备：
阳性比照：
融合前采对应实验的小鼠眼球血，，，，，，，37℃安排2h，，，，，，，然后4℃安排2h，，，，，，，最后10000rpm离心10min，，，，，，，取上清，，，，，，，-20℃条件下生涯。。。。。。。（使用条件前解冻，，，，，，，稀释1000倍备用）
阴性比照：
各个阶段作育基留5ml左右，，，，，，，作为阴性比照用。。。。。。。
Elisa检测板准备：
将对应抗原用CB以1μg/ml浓度加入96孔酶标板内（100μl/孔），，，，，，，4℃住宿静置包被。。。。。。。用1×PBST洗板2遍，，，，，，，洗濯竣事，，，，，，，加入关闭液关闭，，，，，，，37℃关闭1h，，，，，，，用1×PBST洗板2遍，，，，，，，拍干水分，，，，，，，4℃短期生涯，，，，，，，-20℃恒久生涯。。。。。。。
实验流程：
融合检测：
细胞融合换液后，，，，，，，等4~7天，，，，，，，视察细胞融合状态，，，，，，，大部分细胞作育孔内泛起小细胞团，，，，，，，即可最先检测。。。。。。。
用排枪取融合作育上清100μL/孔至包被好的Elisa检测板中，，，，，，，由于Elisa检测板泉源于外部，，，，，，，切记从细胞作育板中单次取液，，，，，，，不可重复吸收，，，，，，，取一次液换一次枪头，，，，，，，避免污染细胞作育板内细胞，，，，，，，以及交织污染影响检测效果。。。。。。。（每块板预留一孔阳性比照孔，，，，，，，一孔阴性作育基比照孔）
凭证阴性比照和阳性比照的OD值，，，，，，，确定阳性孔，，，，，，，取阳性比照OD值得一半以上的数值为阳性。。。。。。。
第一次亚克�。。。。。。。�
凭证融合检测的数据，，，，，，，挑选阳性孔，，，，，，，将阳性孔中的细胞转移至24孔板中作育扩增，，，，，，，凭证细胞生长情形2~3天后接纳Elisa要领复检，，，，，，，避免假阳性。。。。。。。
挑选24孔板中复检阳性的孔，，，，，，，举行细胞复悬，，，，，，，使细胞在作育基中疏散匀称。。。。。。。用细胞计数板举行计数，，，，，，，计数完成后，，，，，，，凭证计数情形比例稀释细胞悬液，，，，，，，凭证1个/孔的密度匀称铺于96孔细胞作育板中，，，，，，，一个阳性克隆株铺一块细胞作育板板。。。。。。。[一次亚克隆接纳FBS-DMEM(HT),作育基的血清使用浓度略低于融适时的浓度，，，，，，，略高于SP2/0通例作育浓度，，，，，，，可凭证5% 举行区分]
画克�。。。。。。。�
一次亚克隆后，，，，，，，融合细胞在CO2作育箱中作育4~5天后，，，，，，，接纳相差显微镜逐孔视察，，，，，，，在单孔内有且只有一个正圆形细胞团的孔，，，，，，，即为单克隆细胞孔，，，，，，，做好标记。。。。。。。若无无单克隆孔，，，，，，，则挑选细胞团较少的多克隆细胞孔，，，，，，，做好标记。。。。。。。
一次亚克隆检测：
画克隆后，，，，，，，继续作育3~5天，，，，，，，凭证细胞生长情形，，，，，，，接纳Elisa法举行一次亚克隆检测，，，，，，，优选挑选阳性单克隆孔，，，，，，，若无阳性单克隆孔，，，，，，，则挑选克隆数较少的阳性多克隆孔。。。。。。。挑选出来的细胞株转移至24孔扩增作育，，，，，，，举行阳性克隆株复筛，，，，，，，确保挑选的细胞株非假阳性。。。。。。。
二次亚克�。。。。。。。�
将一次亚克隆挑选出来的细胞株，，，，，，，重复一次亚克隆办法。。。。。。。细胞作育基换成FBS-DMEM，，，，，，，作育基的血清使用浓度调解成SP2/0的通例作育浓度。。。。。。。
画克隆
二次亚克隆后4~5天，，，，，，，举行画克隆，，，，，，，单克隆孔做好标记。。。。。。。
二次亚克隆检测：
画克隆后，，，，，，，继续作育3~5天，，，，，，，重复一次亚克隆检测办法，，，，，，，挑选阳性单克隆细胞株，，，，，，，准备举行扩增作育。。。。。。。
建株：
阳性单克隆细胞株需举行至少2次的亚克隆，，，，，，，检测为全阳方可建株！若为了包管稳固性，，，，，，，建议举行第三次亚克隆。。。。。。。
挑出两次检测均为单克隆且全为阳性后，，，，，，，在24孔板中作育扩增，，，，，，，2~3天后用Elisa法举行交织检测（主要针对带标签的卵白抗原）和稳固性判断。。。。。。。
检测及格后挑选一个细胞状态，，，，，，，长势较好且阳性OD值较高的细胞株，，，，，，，转移至6孔板举行作育扩增，，，，，，，2~3天后，，，，，，，用亚型检测试剂盒举行抗体亚型判断。。。。。。。
完成以上判断后，，，，，，，将单克隆细胞株转移至100m细胞作育皿或者T75细胞作育瓶中举行大宗扩增。。。。。。。
扩增完成后将单克隆细胞株举行细胞冻存，，，，，，，标记好细胞名称、冻存者、冻存日期等信息，，，，，，，安排冻存盒中，，，，，，，转移到-80℃冰箱，，，，，，，一天后转移至液氮罐中贮存。。。。。。。
冻存后一周再苏醒检测，，，，，，，避免细胞株泛起产抗不稳固征象，，，，，，，若检测没有问题，，，，，，，则将细胞株录入细胞库中，，，，，，，并撰写实验报告。。。。。。。（细胞冻存3支/株，，，，，，，且3支确保有2个及以上冻存批次，，，，，，，阻止泛起冻存失误，，，，，，，细胞株丧失）
使用到的NEST产品：
10μL、200μL、1000μL吸头
96/24/6孔细胞作育板
15mL、50mL无菌离心管
100mm细胞作育皿
T75细胞作育瓶
96孔酶标板
